Amplificación de un gen mediante PCR
Si se integran determinados requerimientos moleculares (enzimas, nucleótidos, cebadores, sitio de restricción) y ciertos requisitos físicos -de pH y temperatura-, el ADN puede replicarse en un tubo de ensayo miles de veces en solo algunos minutos mediante la reacción en cadena de la polimerasa PCR. Este método fue desarrollado en 1993 por el genetista Kary Mullis, quien recibió el Premio Nobel de química por haber logrado la síntesis in vitro de una gran cantidad de fragmentos de ADN.
Este proceso es cíclico y requiere:
- Dos cebadores. Secuencias cortas de ADN empleadas como molde para la síntesis de una nueva cadena.
- Una ADN polimerasa termoestable. La más utilizada es la Taq (aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus), ya que su hábitat natural son las aguas sulfurosas que alcanzan hasta 90 ° C sin que la enzima polimerasa se vea alterada en su funcionamiento.
- Nucleótidos de ADN. Son las cuatro bases nitrogenadas: Adenina, Guanina, Citosina o Timina unidas a un grupo fosfato y a la desoxirribosa; que en su conjunto conforman la molécula de ADN.
- Secuencia de ADN que queremos amplificar.
Cada ciclo comienza con los mismos pasos que la secuenciación del ADN:
*1° Desnaturalización
El ADN duplex es separado en cadenas simples cuando la temperatura a la que se somete es de 94° C.
*2° Hibridación
Cebadores cortos de ADN (de 15 a 20 pares de bases) se agregan a la mezcla para provocar que se unan mediante puentes de hidrógeno a las cadenas individuales de ADN a 54° C.
3° Síntesis
Se agrega ADN polimerasa que cataliza la producción de cadenas nuevas complementarias en dirección 5´→ 3´. La replicación ocurre cuando la temperatura desciende a 72° C.
Para ver el esquema de la reacción de la Cadena Polimerasa da clic en la imagen
PCR: Pasos básicos repetitivos para cada uno de los ciclos para obtener en 20 ciclos un millón de copias de ADN y 1000 millones en 30 ciclos.
La PCR se realiza automáticamente en el termoreciclador, equipo que realiza los ciclos en forma precisa en los tiempos y temperaturas programadas.
Elabora el ejercicio 4 para comprender mejor el tema.