Aislamiento y fragmentación de ADN
Revisa el contenido del siguiente fichero, dando clic en cada pestaña:
Existen diversas técnicas para la extracción del ADN, pero en términos generales, en una primera fase es necesario romper las paredes y membranas celulares de la fuente de extracción como: bacterias, tejidos animales o vegetales, levaduras, entre otras. Esto se logra triturando o macerando la muestra en soluciones amortiguadoras que mantienen el pH neutro (entre 7 y 8). Para incrementar la estabilidad de la molécula de ADN es necesario ejecutar la técnica a temperaturas extremas (4°C ó 60°C) y agregar agentes quelantes como sales de EDTA, detergentes o enzimas pectinasas además de optimizar los tiempos de macerado , con ello es posible inhibir la acción catalítica de las enzimas ADNasas.
En una segunda fase, es necesario realizar la purificación del ADN mediante la incorporación de un detergente catiónico (el CTAB: Bromuro de Cetil-Trimetil-Amonio, es de los más usados) que tiene la función de precipitar el ADN, para posteriormente realizar lavados con solventes orgánicos, como el cloroformo, con la finalidad de eliminar proteínas y metabolitos secundarios del ADN.
Finalmente, es necesario concentrar la molécula de ADN mediante la adición de alcohol que elimina el agua alrededor de la molécula y expone a los grupos fosfatos y a las sales disueltas (cargadas negativamente), provocando que las cadenas de ADN precipiten. De esta manera el ADN queda aislado, listo para usarse en diversas técnicas de ingeniería genética.
Una vez aislado el ADN, para cortarlo se emplean endonucleasas de restricción (enzimas que trozan el ADN de doble cadena entre el hidroxilo 3´de un nucleótido y el fosfato del siguiente en dirección 3´→ 5´) en secuencias específicas llamadas sitio de reconocimiento o sitio de restricción.
Por ejemplo, la enzima Eco RI (aislada de la bacteria E. coli) corta la secuencia en la doble hélice de ADN. La reacción se lleva en dos pasos:
Actualmente se cuenta con cientos de enzimas de restricción obtenidas de diferentes microorganismos, empleando distintas enzimas que se cortan en sitios específicos del ADN en miles de fragmentos, por ejemplo: las secuencias de corte en dirección 5´ → 3´para la enzima Not I es GGATCC; para la enzima Taq 1 es TCGA y para Bam H1 es GCGGCCGC, los fragmentos más grandes se retiran por centrifugación o electroforesis en gel, de tal manera que los fragmentos obtenidos son seleccionados acorde al tamaño del vector de clonación.
La electroforesis es una de las técnicas más empleadas para separar fragmentos de ADN. Consiste en colocar unas muestras del ADN cargados eléctricamente sobre el extremo de una película de gel de agarosa que, sometidas a un campo electromagnético, presentarán una tendencia a desplazarse hacia el polo que posee carga opuesta, en función de su tamaño y forma a lo largo de carriles previamente marcados en el gel. Debido a que el ADN está cargado negativamente por los grupos fosfato de la molécula, la migración se produce del polo negativo al polo positivo; la velocidad de migración de las moléculas está determinada por la fricción que ejerce el gel sobre aquella que se comporta como un tamiz sobre el que corren las partículas; las partículas más pequeñas tienden a desplazarse más rápido que las de mayor tamaño, lo que produce la separación continua de los fragmentos que pueden identificarse por la aparición de pequeñas líneas horizontales que se agrupan en forma de bandas. El proceso de la electroforesis consiste en:
- Preparación del gel
- Sembrado del marcador de tamaño
- Sembrado de las muestras de ADN
- Aplicación del campo eléctrico
- Avance de la corrida
Las bandas pueden identificarse mediante la tinción de las muestras con agentes catiónicos como: el anaranjado de acridina, la proflavina y el bromuro de etidio, que se unen al ADN Dúplex por intercalación, exhibiendo fluorescencia al aplicar luz UV o marcado radioactivo con fosforo radiactivo (32P).
El gel de agarosa es un polisacárido proveniente de las algas que tiene la propiedad de mantenerse líquido sobre los 50 ºC y formar un gel al enfriarse; la trama de fibras poliméricas que lo forman retrasa el paso de las moléculas.
Para visualizar el proceso revisa el siguiente video: Electroforesis en gel de Agarosa.
El revelado de los diferentes fragmentos mediante la tinción con agentes catiónicos como: el anaranjado de acridina, la proflavina y el bromuro de etidio, que se unen al ADN Duplex por intercalación, exhibiendo fluorescencia al aplicar luz UV o marcado radioactivo con fosforo radiactivo (32P).
Cuando se desnaturaliza el ADN en el gel se logra que ambas cadenas de ADN se separen quedando ADN de una sola hebra. Posteriormente se coloca una membrana de nailon en la que se hace una mancha (Blot: el proceso se denomina transferencia o blotting) en el gel y se agrega una muestra de ADN de cadena simple (marcada con 32P) con una secuencia complementaria a la que se busca. Cuando ambas cadenas complementarias se unen, indica que la muestra se ha hibridado con la presencia de radioactividad sobre la membrana de nailon.
Finalmente se corta el gel que contiene el fragmento híbrido para retirar el gel y obtener el ADN puro con la secuencia deseada.
El propósito fundamental de esta técnica de aislamiento consiste en producir secuencias de ADN con un tamaño adecuado para poder manipularlos y analizarlos.
Te sugerimos realizar el ejercicio 2